PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI NẤM CƯ TRÚ 
TRONG LỚP LÓT MŨ BẢO HIỂM ĐÃ QUA SỬ DỤNG 
BẰNG KỸ THUẬT KHỐI PHỔ PROTEIN (MALDI-TOF)

Đặng Thị Thu Hiền¹,

Bùi Thị Kim Nhung², Vũ Thị Hải Linh¹

¹Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. HCM

²Viện Pasteur TP. HCM

Summary

This study aimed to isolate and identify bacterial species present on helmets used by residents in district 10, Ho Chi Minh City, Vietnam. Helmets, being in direct contact with the scalp in a tropical, humid environment, provide an ideal surface for microbial growth. A total of 63 helmet linings were sampled, and 11 bacterial strains were isolated and identified using MALDI-TOF mass spectrometry. The identified bacteria included Staphylococcus aureus, Dietzia papillomatosis, Bacillus cereus thuringiensis, Kocuria palustris, and Brevibacterium casei, which are known to cause skin infections, along with other non-pathogenic species such as Agrococcus lahaulensis and Bacillus subtilis. The presence of pathogenic bacteria highlights the potential health risks associated with improper helmet hygiene. This research underscores the need for regular cleaning and disinfection of helmets to prevent bacterial accumulation and protect users from skin infections.

1. Đặt vấn đề

Vi sinh vật là một phần không thể tách rời của hệ sinh thái, hiện diện ở hầu hết mọi nơi, bao gồm cả trên bề mặt da người. Tuy nhiên, trong những điều kiện thuận lợi như độ ẩm cao, nhiệt độ ấm và vệ sinh cá nhân không đảm bảo, một số vi sinh vật có thể phát triển quá mức và trở thành tác nhân gây bệnh. Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa với khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, đây là điều kiện thời tiết thuận lợi cho nhiều loại vi nấm gây bệnh phát triển. Thực tế cho thấy khoảng 20 – 25% dân số thế giới mắc nấm da và bệnh nấm da là một trong những bệnh phổ biến nhất thế giới [3]. Tại Việt Nam, nấm da chiếm tỷ lệ: 37,31% hoặc 42,85% [2, 3]. Cùng với đó, thói quen sử dụng các vật dụng cá nhân trong thời gian dài mà không vệ sinh thường xuyên, điển hình là mũ bảo hiểm càng làm tăng nguy cơ tích tụ vi sinh vật gây hại trên bề mặt da.

Theo Nghị định 100/2019/NĐ-CP, mũ bảo hiểm trở thành vật dụng bắt buộc khi tham gia giao thông bằng xe máy [1]. Việc đội mũ bảo hiểm thường xuyên trong điều kiện khí hậu nóng ẩm khiến da đầu tiết nhiều bã nhờn và mồ hôi. Các dịch tiết cơ thể trên da đầu thấm vào lớp vải lót bên trong mũ, tạo môi trường lý tưởng cho vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm phát triển. Một trong những biểu hiện thường gặp là tình trạng nhiễm nấm da đầu – một thể viêm nhiễm khu trú tại chân tóc, chủ yếu do vi nấm sợi cơ hội gây ra. Đây là bệnh lý da phổ biến ở cả hai giới, với biểu hiện lâm sàng đặc trưng là ngứa, bong vảy da đầu, và đôi khi kèm theotóc gãy rụng tại những vùng da bị tổn thương, dẫn đến các mảng tóc thưa hoặc hói nhẹ. Mặc dù nấm da đầu không đe dọa tính mạng, bệnh thường có xu hướng dai dẳng, khó điều trị dứt điểm và dễ tái phát. Điều này ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng cuộc sống và tâm lý của người bệnh, gây mất thẩm mỹ và bất tiện trong sinh hoạt hàng ngày.

Trong khi quần áo có thể được giặt sạch thường xuyên, mũ bảo hiểm lại thường được sử dụng liên tục mà ít khi được vệ sinh định kỳ. Trên thực tế, mũ bảo hiểm bẩn có thể trở thành “ổ chứa” vi sinh vật gây bệnh nếu không được làm sạch đúng cách.Một nghiên cứu gần đây cho thấy mũ bảo hiểm đã qua sử dụng có thể chứa số lượng lớn vi sinh vật: các nhà khoa học đã phân lập được tới 23 chủng vi nấm khác nhau từ những mũ bảo hiểm được khảo sát [8].  Do đó, việc nghiên cứu, phân lập các vi nấm cư trú trong lớp lót mũ bảo hiểm là cần thiết để xác định những vi sinh vật tiềm ẩn nguy cơ gây bệnh. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp dữ liệu ban đầu về các chủng vi nấm phổ biến trên bề mặt tiếp xúc với da đầu, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về phương pháp vệ sinh và khử khuẩn mũ bảo hiểm một cách hiệu quả.

Thông qua việc phân lập các vi nấm có trong mũ bảo hiểm, nghiên cứu này cung cấp thông tin cần thiết để đề xuất các biện pháp làm sạch và bảo quản mũ bảo hiểm phù hợp, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm vi nấm cho người sử dụng. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức của cộng đồng về tầm quan trọng của vệ sinh cá nhân, đặc biệt là vệ sinh mũ bảo hiểm – một vật dụng bảo hộ thiết yếu trong cuộc sống hàng ngày.

Nghiên cứu được thực hiện tại khu dân cư đông đúc (chung cư Phường Bảy Hiền, TP. Hồ Chí Minh), nơi mà các mẫu mũ bảo hiểm đã qua sử dụng được thu thập và phân tích. Để định danh các vi nấm phân lập được, nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật khối phổ protein - Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight (MALDI-TOF). Đây là một công nghệ hiện đại trong vi sinh, cho phép xác định danh tính vi sinh vật dựa trên phổ protein của từng loài. Kỹ thuật tiên tiến này có nhiều ưu điểm vượt trội như khả năng định danh vi khuẩn và nấm nhanh chóng với độ chính xác cao, đồng thời tiết kiệm chi phí so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Việc áp dụng MALDI-TOF trong nghiên cứu không chỉ nâng cao chất lượng và độ tin cậy của kết quả định danh, mà còn gia tăng tính ứng dụng thực tiễn – giúp đề xuất những biện pháp vệ sinh, phòng chống các bệnh nấm da liên quan đến mũ bảo hiểm một cách hiệu quả hơn cho cộng.

2. Thực nghiệm

2.1. Thiết bị, dụng cụ và môi trường

2.1.1.   Thiết bị, dụng cụ

Bảng 1. Danh mục thiết bị

Bảng 2. Danh mục dụng cụ

2.1.2.   Môi trường

Bảng 3. Danh mục môi trường

2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.2.1.   Đối tượng nghiên cứu

46 miếng lót bên trong mũ bảo hiểm đang sử dụng (tại vị trí tiếp xúc trực tiếp với tóc và da đầu người sử dụng) của dân cư chung cư phường Bảy Hiền, TP. Hồ Chí Minh. Các mẫu được kí hiệu theo nghề nghiệp của người sử dụng nón bảo hiểm như Bảng 4.

Bảng 4.Thông tin ký hiệu mẫu

2.2.2.   Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Thu và bảo quản miếng lót nón bảo hiểm

• Các mũ bảo hiểm đang được sử dụng thường xuyên trong sinh hoạt hằng ngày;
• Miếng lót không bị rách và chưa được giặt hoặc xử lý bằng hóa chất sát khuẩn trong vòng 7 ngày trước khi lấy mẫu;
• Mỗi miếng lót được đặt riêng biệt vào túi vô trùng và được xử lý mẫu thu vi nấm trong vòng 24 giờ. Nếu chưa thực hiện được quy trình phân lập thì phải bảo quản mẫu ở
  2 ^oC - 8 ^oC không quá 48 giờ.

2.2.2.2. Xử lý mẫu

• Dùng kẹp đã tiệt khuẩn gắp các miếng lót ra khay inox đã tiệt khuẩn;
• Các miếng lót sẽ được cắt nhỏ khoảng 2 x 2 cm và cho vào chai duran 1000 ml;
• Thêm vào 500 ml dung dịch đệm NaCl peptone và lắc đều ở tốc độ 250 vòng/phút trong 15 phútđể vi nấm phân tán vào dung dịch đệm.;

2.2.2.3. Phân lập vi nấm có trong miếng lót

• Chuyển dung dịch đệm sau khi lắc với miếng lót nón bảo hiểm qua màng lọc 0,45 µm và hút chân không;
• Lại thêm 500 ml dung dịch đệm NaCl peptone vào chai chứa tấm lót và lắc đều lần 2 trong 15 phút;
• Tiếp tục chuyển dung dịch đệm sau khi lắc với miếng lót nón bảo hiểm lần 2 qua màng lọc 0,45 µm ban đầu và hút chân không;
• Chuyển giấy lọc vào chai duran 250 ml có chứa bi thủy tinh và thêm vào 100 ml môi trường SDB lắc đều 30 phút để vi sinh vật bong ra khỏi màng loc và phục hồi vi sinh vật;
• Hút 1 ml dịch chứa vi sinh vật từ màng lọc ra trãi lên đĩa môi trường như sau:
• Trãi lên môi trường SDA (có chứa Chloramphenicol 50 mg/l) và ủ tìm vi nấm ở nhiệt độ từ 20 ^oC đến 25 ^oC trong 3 đến 5 ngày.
• Thực hiện trãi mỗi mẫu lên 10 đĩa SDA.

Hình 1. Hình miếng lót bên trong nón bảo hiểm (mặt trên là mặt tiếp xúc với da đầu) và chai dung dịch đệm NaCl pepton chứa các miếng lọt đã được cắt nhỏ kích thước 2 x 2 cm

Hình 2. Phân lập vi nấm trong miếng lót nón bảo hiểm bằng phương pháp lọc chân không

A. Bộ lọc dung dịch có chứa vi sinh vật từ miếng lót bảo hiểm.

B. Sau khi lọc, màng lọc sẽ giữ lại vi sinh vật và có lẫn các sợi vải từ miếng lót bung ra trong quá trình cắt và lắc mẫu

2.2.2.4. Định danh các vi nấm bằng kỹ thuật MALDI-TOF

• Sau khi ủ, các khuẩn lạc được quan sát, phân biệt theo hình thái học. Mỗi đĩa sẽ chọn ra các khuẩn lạc có hình thái khác nhau.
•  Các khuẩn lạc vi nấm có hình thái khác nhau sẽ được cấy 3 điểm làm thuần lên môi trường SDA và ủ 20 ^oC – 25 ^oC trong 48 giờ đến 72 giờ.
• Chọn các đĩa có khuẩn lạc vi nấm thuần thì cấy chuyển tơ nấm sang ống nghiệm có chứa sẵn bi thủy tinh và 20 ml môi trường SB đã tiệt khuẩn. Các ống sẽ được ủ ở nhiệt độ 20 ^oC – 25 ^oC trong 48 giờ và định danh bằng kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF.

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Tình trạng vi nấm xuất hiện trong miếng lót bảo hiểm

Sau khi tiến hành thu thập và xử lý 46 miếng lót mũ bảo hiểm theo quy trình, kết quả nuôi cấy cho thấy có 46/46 mẫu có vi nấm phát triển trên môi trường nuôi cấy SDA. Tình trạng mọc vi nấm từ các mẫu phân lập được trình bày Bảng 5.

Bảng 5. Tình trạng mọc vi sinh vật trên các mẫu

3.2. Các khuẩn lạc vi nấm được phân lập và định danh

Trong quá trình phân lập vi khuẩn trong 49 miếng lót trong nón bảo hiểm nhóm nghiên cứu đã ghi nhận 10 khuẩn lạc vi nấm có đặc điểm hình thái khác nhau và được định danh bằng kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF. Kết quả được trình bày ở Bảng 6.

Bảng 6. Hình ảnh và thông tin đặc điểm các vi nấm phân lập từ miếng lót nón bảo hiểm

3.3. Tần suất xuất hiện của các chủng vi nấm đã phân lập

Tổng cộng 46 mẫu mũ bảo hiểm đã qua sử dụng được thu thập từ bốn nhóm nghề nghiệp khác nhau, bao gồm: xe ôm công nghệ (16 mẫu), công an (8 mẫu), công nhân (12 mẫu)và sinh viên (10 mẫu). Quá trình phân lập và định danh bằng kỹ thuật MALDI-TOF cho thấy sự hiện diện của 10 loài vi nấm khác nhau thuộc các chi phổ biến như Aspergillus, Fusarium, Penicillium, với mức độ phân bố không đồng đều giữa các nhóm nghề được mô tả ở Bảng 7.

Bảng 7. Tần suất xuất hiện các chủng vi nấm

Có thể thấy, chi Aspergillus chiếm ưu thế rõ rệt với 6/10 loài được phân lập, trong đó 3 loài có tỷ lệ xuất hiện cao nhất là:

• Aspergillus flavus/oryzae (63,0%), đây một loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin, gây nguy cơ dị ứng hô hấp và viêm da[4].
• Aspergillus nidulans (60,9%), được biết đến như một tác nhân cơ hội gây nhiễm trùng ở người suy giảm miễn dịch[6].
• Aspergillus brasiliensis (54,3%), loài này liên quan đến các ca viêm da, nhiễm trùng tai ngoài và phản ứng dị ứng[7].

Ngoài ra, các chủng Penicillium sp.và Fusarium sp. cũng được ghi nhận với tần suất thấp hơn nhưng có khả năng gây nhiễm nấm da, viêm mũi dị ứng và thậm chí là nhiễm trùng xâm lấn ở người suy yếu miễn dịch [5, 9].

Bên cạnh đó, kết quả còn cung cấp một cách tổng thể về mối liên hệ giữa nghề nghiệp người sử dụng nón bảo hiểm và sự hiện diện vi nấm. Theo đó:

• Nhóm xe ôm công nghệ (XC) có tỷ lệ xuất hiện các loài vi nấm cao nhất, đặc biệt là A. flavus, A. nidulans, A. brasiliensis và A. unguis. Điều này có thể lý giải bởi đặc điểm công việc đặc thù nghề nghiệp như phải đội mũ bảo hiểm gần như liên tục trong môi trường nhiệt đới ẩm, ít có điều kiện làm sạch nón thường xuyên.
• Nhóm công nhân (CN) cũng ghi nhận tỷ lệ cao với sự xuất hiện của nhiều loài vi nấm có khả năng gây bệnh ngoài da như A. unguis, A. versicolor, P. brevicompactum. Việc làm việc trong môi trường nóng, bụi, và có thể không đảm bảo vệ sinh cá nhân thường xuyên là yếu tố nguy cơ.
• Nhóm sinh viên (SV) và công an (CA) có số lượng mẫu ít hơn, tuy nhiên vẫn xuất hiện nhiều loài vi nấm phổ biến.

Đáng chú ý, A. flavus, A. nidulans và A. brasiliensis đều xuất hiện ở cả 4 nhóm nghề nghiệp, cho thấy sự phổ biến rộng rãi và khả năng thích nghi cao của các loài này trong môi trường lớp lót mũ bảo hiểm.

4. Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập thành công 10 loài vi nấm từ 46 miếng lót mũ bảo hiểm đã qua sử dụng, đại diện cho bốn nhóm nghề nghiệp khác nhau trong cộng đồng dân cư tại TP. Hồ Chí Minh. Trong đó, chi Aspergillus chiếm ưu thế vượt trội, với ba loài có tỷ lệ xuất hiện cao nhất là A. flavus/oryzae (63,0%), A. nidulans (60,9%) và A. brasiliensis (54,3%). Các loài vi nấm này đều có khả năng gây các bệnh lý da và hô hấp, đặc biệt ở những người có cơ địa dị ứng hoặc hệ miễn dịch suy giảm.

Kết quả cũng cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm nghề nghiệp, trong đó nhóm xe ôm công nghệ và công nhân có nguy cơ nhiễm vi nấm cao hơn do đặc điểm lao động thường xuyên tiếp xúc môi trường nóng ẩm và ít có điều kiện vệ sinh cá nhân hoặc vệ sinh mũ bảo hiểm định kỳ. Đặc biệt, sự hiện diện đồng thời của các loài vi nấm gây bệnh ở cả bốn nhóm nghề nghiệp nhấn mạnh tính phổ biến và khả năng thích nghi cao của các chủng nấm trong môi trường lớp lót mũ bảo hiểm.

Từ các kết quả thu được, nghiên cứu nhấn mạnh tầm quan trọng của việc vệ sinh, làm sạch và bảo quản lớp lót mũ bảo hiểm một cách định kỳ để hạn chế sự tích tụ và phát triển của vi nấm gây bệnh. Việc sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF trong định danh nấm đã chứng minh hiệu quả cao trong việc nhận diện chính xác, nhanh chóng và tiết kiệm thời gian, góp phần nâng cao chất lượng giám sát vi sinh trong các môi trường tiếp xúc cộng đồng.

Kết quả này là cơ sở khoa học quan trọng để xây dựng các khuyến nghị về vệ sinh cá nhân, đặc biệt là vệ sinh mũ bảo hiểm – một vật dụng bảo hộ thiết yếu nhưng thường bị bỏ quên trong thói quen chăm sóc sức khỏe hằng ngày của người dân.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y tế (2019), “Nghị định 100/2019/NĐ-CP: Quy định xử phạt vi phạm hành chính trong lĩnh vực giao thông đường bộ”, Công báo Chính phủ, số 102, tr. 12–30.
2. Huỳnh Quốc Tuấn, Vũ Tuấn Anh, Hoàng Thị Thúy Hương và cộng sự (2019), “Nghiên cứu tình hình nhiễm nấm da niêm mạc ở người tại Bệnh viện Phong - Da liễu Trung ương Quy Hòa từ năm 2015 đến năm 2018”, Tạp chí Y dược Lâm sàng 108, 14(1), 64–69.
3. Nguyễn Thái Dũng (2017), “Nghiên cứu đặc điểm nhiễm nấm da, định danh loài bằng hình thái học, sinh học phân tử và kết quả điều trị bằng terbinafine”, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân y, Hà Nội.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH

4. Gauthier, G.M. (2022), “Aspergillus flavus and the paradox of genetic diversity: Insight into mechanisms of pathogenesis”, Microbiology Spectrum, 10(2), 22.
5. Nucci, M. & Anaissie, E. (2007), “Fusarium infections in immunocompromised patients”, Clinical Microbiology Reviews, 20(4), 695–704.
6. O'Gorman, C.M. (2024), “The emerging significance of Aspergillus nidulans in human disease”, Frontiers in Microbiology, 15, 1428415.
7. Salas, V. et al. (2023), “Keratomycosis caused by Aspergillus brasiliensis: case report”, Journal of Medical Case Reports, 17, 42.
8. SK Jasmine Shahina, Premi S, Shabana Thabasum I, and Summera Rafiq (2022), “Motorcycle Helmets as Potential Fomites in Transmission of Pathogenic Micro-organisms and Antibacterial Activity of Helmet Disinfectant Spray”, Asian Journal of Biological and Life Sciences,11(1), 144-14
9. Siqueira, J.P.Z. et al. (2016), “Penicillium spp. as emerging human pathogens: literature review”, Brazilian Journal of Microbiology, 47(4), 845–854.